錢　淵

中國實(shí)用兒科雜志  2019  Vol.34（2）：97-99

摘要

呼吸道感染是兒科最常見的疾病之一，臨床表現(xiàn)多樣，嚴(yán)重者可致死亡。病毒是最常見的致病原之一，尤其對(duì)于小嬰兒。敏感、特異、快速的病原診斷是正確診治的重要保證。近年來，新的病毒病原診斷方法不斷涌現(xiàn)，該文就各種診斷技術(shù)和方法的優(yōu)缺點(diǎn)和臨床實(shí)際應(yīng)用價(jià)值做一闡述。

關(guān)鍵詞

呼吸道感染；病毒；兒童；病原診斷

作者單位：首都兒科研究所病毒研究室  兒童病毒病病原學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京  100020
電子信箱：yqianbjc@263.net

急性呼吸道疾病是影響人類健康的常見病、多發(fā)病。病毒感染常常是這些疾病的直接病因或激發(fā)因素，對(duì)于兒童（尤其是嬰幼兒）更是如此。兒童呼吸道病毒感染的臨床表現(xiàn)多樣，從輕微的、自限性的上呼吸道感染到嚴(yán)重的甚至是致死性的下呼吸道感染，季節(jié)性明顯，往往會(huì)在短時(shí)間內(nèi)引起門、 急診患兒的突然大幅度增加， 隨之而來的是住院床位的供不應(yīng)求，這些都對(duì)兒科臨床造成巨大的壓力。因此，兒科醫(yī)務(wù)工作者準(zhǔn)確識(shí)別呼吸道病毒感染，制定恰當(dāng)?shù)脑\治策略和應(yīng)對(duì)措施，避免抗生素的過度使用是個(gè)非常重要的臨床實(shí)際問題。

1　兒科呼吸道病毒病原的診斷概況

2000年以前， 兒科最常見的、 經(jīng)典的呼吸道病毒包括： 呼吸道合胞病毒、 流感病毒（甲型和乙型）、 腺病毒、 副流感病毒（1、 2、 3型）。之所以說是“最常見的”和“經(jīng)典的”， 是因?yàn)檫@些呼吸道病毒發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)50年代以后， 與急性呼吸道感染的病原關(guān)系的確定經(jīng)歷了病毒分離、 血清學(xué)試驗(yàn)（雙份血清）和流行病學(xué)研究， 因此這些結(jié)果和結(jié)論翔實(shí)可靠、經(jīng)久不衰。2000年以后，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷創(chuàng)新、 推廣和應(yīng)用， 人偏肺病毒、 鼻病毒和副流感病毒（4型）與兒科急性呼吸道感染的關(guān)系逐漸被大家所認(rèn)識(shí)和重視。還有一些新發(fā)的病毒（如博卡病毒）， 雖然病原學(xué)關(guān)系尚待確認(rèn)， 但是由于較高的檢出率， 也引起了大家的高度關(guān)注［1］ 。

由于新的技術(shù)和方法不斷研發(fā)和推出，現(xiàn)代的病毒感染的病原診斷可以根據(jù)各醫(yī)院的具體情況選擇不同的技術(shù)和方法，并且可以通過融會(huì)貫通、聯(lián)合應(yīng)用多種技術(shù)，使得病毒病原的診斷更加切合患兒的實(shí)際（即不同的病程階段和病情嚴(yán)重程度）［1］。可用的技術(shù)包括病毒分離（僅限于常見呼吸道病毒，仍為不容置疑的金標(biāo)準(zhǔn)）、用各種免疫學(xué)方法檢測(cè)病毒抗原（如直接或間接免疫熒光法、酶聯(lián)免疫法、免疫層析法等）和病毒核酸擴(kuò)增法（檢測(cè)病毒的基因-DNA或者RNA）。這三種類型是在感染的相應(yīng)部位檢測(cè)病毒；還可以用檢測(cè)病毒特異性抗體的方法（血清學(xué)試驗(yàn)）來做出病毒病原診斷，要根據(jù)患兒的不同的病程階段來考慮選擇檢測(cè)不同的特異性抗體種類。具體的方法在這期《中國實(shí)用兒科雜志》有專門的文章介紹，本文不贅述。本文將結(jié)合文獻(xiàn)、國內(nèi)兒科臨床的具體情況和筆者所在實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)和體會(huì)，就當(dāng)前面對(duì)眾多的方法和技術(shù)，兒科醫(yī)師和醫(yī)院的病毒病原檢測(cè)的相關(guān)部門如何選擇診斷技術(shù)作一個(gè)簡要論述，以供參考。

1.1　病毒分離　盡管常見呼吸道病毒的分離是公認(rèn)的、無可置疑的病原診斷金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于絕大部分的兒童醫(yī)院來說還是無法做到，只有少部分兼做研究的醫(yī)院可做。用病毒分離的方法，連續(xù)性地每年從患兒的臨床標(biāo)本中分離到各種呼吸道病毒的流行毒株，對(duì)于診斷病毒學(xué)的可持續(xù)發(fā)展是一項(xiàng)十分重要、不可或缺的工作［2］。

1.2　病毒抗原檢測(cè)　病毒抗原是指在病毒侵入呼吸道上皮細(xì)胞后活躍復(fù)制、增殖的過程中產(chǎn)生的病毒蛋白，因?yàn)榭梢栽诟腥具^程中刺激肌體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體而稱為抗原。病毒只有在侵入靶細(xì)胞并且活躍增殖的情況下才能引起呼吸道癥狀。因此在疾病的早期，抗原檢測(cè)（不管采用何種方法）是對(duì)于病原確定以便正確診治的好策略！其診斷價(jià)值不亞于傳統(tǒng)的病毒分離或快速病毒分離（shell vial），并且因?yàn)槌鼋Y(jié)果快而使得其實(shí)用性優(yōu)于病毒分離［3］。而諸多的抗原檢測(cè)方法中，直接或間接免疫熒光法因?yàn)樾枰杉交純旱暮粑烂撀渖掀ぜ?xì)胞（呼吸道病毒感染的靶細(xì)胞）作為檢測(cè)的標(biāo)本，熒光標(biāo)記的單克隆抗體與在細(xì)胞中病毒感染后增殖的特定部位［細(xì)胞核和（或）細(xì)胞漿］結(jié)合，在熒光顯微鏡下可以直觀地看到特征性的定位熒光而判斷結(jié)果，因此，有很強(qiáng)的特異性。在發(fā)病的早期，抗原檢測(cè)即可顯示熒光陽性［4］。該方法在采集到高質(zhì)量標(biāo)本（含足夠量的呼吸道脫落上皮細(xì)胞）前提下，敏感性和特異性可以與病毒分離相當(dāng)；另外，因操作時(shí)間相對(duì)較短（2～3 h），符合臨床上敏感、特異和快速的要求［3］，因此，在相當(dāng)長的時(shí)期內(nèi)成為國內(nèi)外兒科的病毒診斷實(shí)驗(yàn)室的首選方法，并且在當(dāng)前也不失為最好的方法之一，尤其對(duì)于住院患兒來說更是推薦選用。目前有商品化的試劑盒，可以用1份標(biāo)本同時(shí)檢測(cè)7種常見的呼吸道病毒（如果加上偏肺病毒的單克隆抗體，可以檢測(cè)8種呼吸道病毒，國外的試劑盒是這樣組合的）［5］。 免疫層析法（如金標(biāo)法等“紙條法”）因?yàn)槌鼋Y(jié)果快、操作簡便（操作人員不需要特殊的技術(shù)專長），在臨床上也是十分受歡迎，國外的?？漆t(yī)師診所（成人及兒科）內(nèi)由醫(yī)師或護(hù)士直接操作，國內(nèi)還是由臨床檢驗(yàn)部門來做。目前國內(nèi)外應(yīng)用最多的“紙條法”是流感病毒（甲型/乙型），質(zhì)量好的試劑盒在敏感性和特異性上可與病毒分離相比［6］。國外兒科廣泛應(yīng)用的免疫層析法還有呼吸道合胞病毒、腺病毒［3］，而國內(nèi)尚處于開始階段。相比免疫熒光法，“紙條法”取1份標(biāo)本只能做單一的病毒，對(duì)標(biāo)本的質(zhì)量（是否采集到足夠量的上皮細(xì)胞）也無法判斷，故對(duì)于普遍反映該方法的敏感性低的問題筆者在此難以評(píng)價(jià)。

1.3　病毒核酸檢測(cè)　病毒核酸檢測(cè)是隨著20世紀(jì)80年代末聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)發(fā)明以來快速發(fā)展起來的。由于與抗原檢測(cè)相比，核酸擴(kuò)增技術(shù)的敏感性大大的增加了檢出率，而且實(shí)時(shí)熒光PCR或RT-PCR又可以克服早期PCR技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室污染問題的瓶頸，使得核酸檢測(cè)在呼吸道病毒病原診斷中快速地得到推廣應(yīng)用。近年來，多重PCR技術(shù)使得用同一管反應(yīng)能夠同時(shí)檢測(cè)幾乎所有的呼吸道病毒，而且隨著反應(yīng)時(shí)間的縮短，儀器的日漸小型化，在一些實(shí)驗(yàn)室多重核酸檢測(cè)的技術(shù)逐步取代了抗原檢測(cè)，尤其是當(dāng)一些新上市的試劑盒是以“癥狀為組合”為設(shè)計(jì)理念的（developed as syndromic panels），加上了如肺炎支原體、肺炎衣原體等呼吸道病毒以外的常見病原，更加受到了臨床的青睞。然而盡管有這些突出的優(yōu)點(diǎn)，核酸檢測(cè)的短處也日益顯露出來。首先，核酸擴(kuò)增法檢測(cè)過于靈敏，有極少量的病毒基因也能被檢測(cè)到，而且由于可檢測(cè)到病毒核酸的時(shí)間窗長，陽性結(jié)果不能明確告訴醫(yī)師是本次感染的病毒病原，還是以前（上次）感染遺留的病毒核酸，該病毒是否還有感染性（傳染性）［7］。多重PCR還往往得到兩種以上病毒同時(shí)陽性的結(jié)果，以至于很難判斷哪種病毒是本次臨床疾病的病原；這種情況在抗原檢測(cè)中就很少發(fā)生，因?yàn)榭乖瓩z測(cè)法得到的是病毒活躍增殖中產(chǎn)生的病毒蛋白，而且在發(fā)病早期出現(xiàn)，陽性結(jié)果維持時(shí)間不長，在急性呼吸道感染中，陽性結(jié)果從臨床癥狀出現(xiàn)時(shí)起，一般維持7 d左右（最長不超過10 d）并呈逐漸減弱的趨勢(shì)。所以，抗原檢測(cè)仍然有著其他方法所缺乏的優(yōu)勢(shì)［3］，那就是與病毒活躍增殖的密切相關(guān)性所決定的對(duì)病原診斷的可靠性。

2    兒科呼吸道病毒病原的診斷所面臨的挑戰(zhàn)

盡管病毒病原診斷的技術(shù)日新月異，也被越來越多的醫(yī)院臨床所接受應(yīng)用，呼吸道病毒病原的診斷仍然面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

最突出的是理念的挑戰(zhàn)！有一種觀點(diǎn)非常具有代表性，那就是由于大多數(shù)呼吸道病毒缺乏特異的治療藥物，臨床醫(yī)師會(huì)認(rèn)為準(zhǔn)確的病毒病原診斷的實(shí)際意義不大，根據(jù)血常規(guī)、C反應(yīng)蛋白等檢測(cè)結(jié)果判斷是病毒感染，對(duì)癥治療就是了。這種想法阻礙了病毒病原的診斷。實(shí)際上不同的病毒所引起的疾病預(yù)后是不一樣的，不同的呼吸道病毒可能引起相似的臨床表現(xiàn)，而有了準(zhǔn)確的病原診斷，一定會(huì)促進(jìn)臨床的診斷和治療。例如，在當(dāng)前（2018—2019年流感季）流感流行中，如果沒有流感病毒的病原診斷，不會(huì)使臨床醫(yī)師認(rèn)識(shí)流感合并的腦病，會(huì)把腦病當(dāng)成一般的病毒性腦炎和腦膜炎，而忽略流感本身。還有，即使在流感高峰季節(jié)，流感樣病例中仍有相當(dāng)一部分是由流感病毒以外的呼吸道病毒引起的，如果不做病原檢測(cè)而盲目使用抗流感藥物，會(huì)使得耐藥毒株快速生成。因此，臨床醫(yī)師對(duì)病原檢測(cè)必要性的認(rèn)識(shí)是十分重要的，臨床醫(yī)師的需求直接影響了一個(gè)醫(yī)院的病毒病原診斷的應(yīng)用、發(fā)展和進(jìn)步。 

其次，盡管目前市場(chǎng)上供應(yīng)的診斷試劑很多，而且還在不斷增加，可應(yīng)用于臨床的（即有批準(zhǔn)文號(hào)的）診斷試劑遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求，而且良莠并存，因此，在應(yīng)用于臨床前，應(yīng)該認(rèn)真地做好擬采用的試劑盒的質(zhì)控和評(píng)估，最理想的是與公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比較，以保證檢測(cè)質(zhì)量的可靠性，這在發(fā)達(dá)國家的臨床檢驗(yàn)科已經(jīng)是常規(guī)了，在國內(nèi)可能大部分的兒科醫(yī)院都做不到，所以會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的可靠性大打折扣。此外，在應(yīng)用了某一種診斷方法和試劑一段時(shí)間后，應(yīng)該及時(shí)總結(jié)和回顧所用試劑的敏感性、特異性和可靠性，加強(qiáng)同臨床醫(yī)師的溝通，以不斷改進(jìn)。

最后，也是不能忽視的最重要的一點(diǎn)，采集到合格的標(biāo)本是取得可信結(jié)果的第一步，也是基本保證！臨床上要對(duì)采集標(biāo)本的人員（住院醫(yī)師或護(hù)士）進(jìn)行培訓(xùn)，而檢驗(yàn)人員應(yīng)該對(duì)送來的標(biāo)本進(jìn)行初步評(píng)估，看是否真正采集到了符合要求的標(biāo)本。因?yàn)橹挥胁《驹诩?xì)胞內(nèi)快速增殖才能引起相應(yīng)的疾病，檢測(cè)到的結(jié)果才是真正可信的結(jié)果。對(duì)于不合格的標(biāo)本，不能簡單地打上“陰性”了事，而要注明標(biāo)本“不合格”，以便于臨床醫(yī)師對(duì)結(jié)果做出客觀的判斷。

3    結(jié)語與展望

盡管與發(fā)達(dá)國家相比，我們的呼吸道病毒病原診斷的廣度和深度都存在著很大的差距，但是我們的進(jìn)步已經(jīng)在路上。《中國實(shí)用兒科雜志》作為在我國兒科同行中頗具影響力的學(xué)術(shù)期刊，本期重點(diǎn)選題的設(shè)計(jì)和實(shí)施就是有力的說明！相信隨著病毒病原診斷技術(shù)的不斷進(jìn)步發(fā)展和普及應(yīng)用，兒科同道們對(duì)病毒性呼吸道感染的認(rèn)識(shí)和診治水平會(huì)得到長足的進(jìn)步，這是一項(xiàng)使醫(yī)患雙方都能獲益的舉措。

參考文獻(xiàn) (略)